備戰高考：教材中的“PCR技術”釋疑

大慶市高中生物學劉錫凱名師工作室

<h3>DNA分子在PCR儀中擴增與在細胞內復制相似，也需要原料、能量、酶、引物、適宜的溫度和pH?等，但PCR技術操作中不需要單獨提供ATP?作為供能物質．在PCR?技術中，DNA?復制的解旋斷裂氫鍵的能量來自PCR?儀的加熱，高溫達90℃~ 95℃?時DNA?分子雙鏈即打開，dNTP的連接能量來源于Taq酶聚合基本單位dNTP加入到延伸鏈的3'端與上一個核苷酸形成磷酸二酯鍵時釋放一個焦磷酸PPi，焦磷酸不穩定極易水解，釋放能量并產生磷酸，這二個反應互相偶聯，推動Taq酶聚合單體延伸DNA?分子．</h3></br><h3> <h3>問題2? ?PCR技術中加入的“引物”是什么? ?有什么作用?</h3></br><h3>引物會在PCR儀中復制嗎?</h3></br><h3>引物是在DNA分子復制時起引導作用一段短RNA或單鏈DNA片段，可結合在脫氧核苷酸鏈上與之互補配對的區域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，DNA聚合酶可由其3'端開始合成新的核酸鏈．細胞內的引物是RNA?鏈，由RNA?酶根據DNA鏈堿基序列自動合成。</h3></br><h3>在PCR技術中，引物是人工合成的兩段寡核苷酸鏈序列，是單鏈DNA片段．由于DNA聚合酶的特異性和DNA分子兩條鏈的兩端的差異性，決定了DNA分子體外擴增時必需設計兩種引物，分別與DNA分子兩條模板鏈的兩端的感興趣區域互補，以利于DNA聚合酶由此定向向前延伸，起到很好的引導作用．對于一段需擴增的DNA的核苷酸序列，引物可根據這一序列經計算機設計并合成，使其能有效地擴增模板DNA序列，引物設計的優劣直接關系到PCR技術擴增DNA的成功與否。<br></br></h3></br><h3>引物不會在PCR儀中復制，引物是設計并配比好后加入PCR ?儀溶液中的。體外人工設計的引物廣泛用于DNA聚合酶鏈反應(PCR?技術)、測序和探針合成等。</h3></br><h3>問題3? ?在PCR技術操作中，加的兩種引物在有何特別的要求?</h3></br><h3>在PCR技術中，引物的設計非常關鍵，它的長度、特異性等都會影響到DNA擴增效率．設計引物要求做到: ①引物長度一般在?15～30 個堿基之間，這可以保證它的特異性; ②每一個引物中?G + C 含量在 40% ～60% 之間，且比例差異不大，保證操作過程中溫度控制同步; ③堿基要隨機分布，引物自身不能有連續4 個堿基的互補，防止自身形成發夾式結構，影響擴增效率;④兩個引物之間不能有穩定的二聚體或發夾式結構存在;⑤引物不能在別的非目區域引起高效的DNA聚合反應(錯配)。</h3></br><h3> <h3>問題4? ?在?PCR 技術操作中，為何加的引物中 C、G比例越高，退火溫度越高? ?兩個引物中的 G、C比值差異不能太大?</h3></br><h3>引物的一個重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當引物和互補序列配對為雙鏈DNA分子時的溫度．Tm對于設定PCR退火溫度是多少必需的參照的值．在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效配對，同時還要足夠高，以減少引物與其它非感興趣的部分進行非特異性結合的配對．合理的退火溫度一般在55℃左右，退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃.設定Tm ?值有的是根據引物中G、C?含量估算，確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法，即開始以低于估算的Tm ?低5℃?, ?再以2℃為增量，逐漸提高退火溫度，較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產生的形成，從而保證了DNA分子延伸過程中的順利性與正確性．G、C?含量影響退火溫度是因為堿基對之間的結合三個氫鍵，A、T?對之間有兩個氫鍵，打開這些堿基對所需的能量不一樣，所以引物中C、G比例越高，退火溫度越高．</h3></br><h3>為獲得最佳結果，設計的兩個引物應具有近似的Tm值．若由于DNA分子兩端序列的特異性而導致引物對的Tm差異較大，為了提高特異性可以根據較高Tm設計的退火溫度先進行5?個循環，然后再根據較低Tm值設計的退火溫度進行剩余的循環，這可以使得在較為嚴緊的條件下獲得目的模板的部分拷貝．</h3></br><h3> <h3>問題5 ? ?為什么細胞內?DNA復制的引物是?RNA? ?PCR的引物是?DNA?</h3></br><h3>細胞內DNA分子復制過程可概括為:?</h3></br><h3>(1) 雙鏈的解開;</h3></br><h3>(2)RNA引物的合成;?</h3></br><h3>(3)?DNA?鏈的延伸;?</h3></br><h3>(4) 切除RNA引物，填補缺口并連接相鄰的DNA片段．迄今為止，無論在原核生物還是在真核生物中所發現的DNA聚合酶，都必須有模板鏈和3'—OH?末端的引物鏈存在，才能合成新的DNA?鏈(由5，－3，方向延伸)．這就需要在DNA復制起始階段由RNA聚合酶首先合成一小段RNA?為引物，RNA引物就提供了這個羥基，DNA聚合酶III才會真正開始DNA鏈的合成。</h3></br><h3>在細胞中只有RNA聚合酶可以從頭合成RNA，合成的RNA?與模板鏈結合，從而引導DNA分子子鏈的延伸．而DNA?聚合酶由于它的保真系統決定它不能從頭合成DNA單鏈，所以DNA?復制時先由RNA聚合酶合成一段RNA鏈，再由DNA聚合酶起到DNA分子復制時的延伸功能，形成互補的子鏈．</h3></br><h3>再從DNA分子復制的忠實性看，一般DNA分子兩端的堿基對不穩定，因此在合成起始段時，開頭的幾個堿基如果發生差錯將不易校正．為了保證產生高保真的DNA分子就得先延長一個要丟棄的引物，使新加上的堿基嚴格按照堿基互補配對和上下文的聯系，以保證復制的忠實性，即中途配對有差錯也會通過酶自動修復．另外，使用RNA?作為合成DNA的引物，主要在于它易被DNA聚合酶III作為DNA合成終止的信號所識別，使DNA聚合酶I進行切口移位，以減少DNA復制的出錯率．如果用DNA單鏈作為引物，則不能被DNA聚合酶III識別，因為DNA、RNA的化學組成不同，從而影響了DNA分子的復制．這有可能是DNA分子復制以RNA為引物的主要原因．</h3></br><h3>在PCR?儀中用的是DNA引物，是人工設計合成，一般不用RNA?作為引物，因為RNA引物需要被切除，而PCR儀中沒有這種酶，再說，若用的RNA引物被切除后將使這個新合成的DNA的兩端都出現了一段單鏈而不穩定．</h3></br><p data-pm-slice="0 0 []">文獻出處：</h3></br><h3>[1]吉祖筠.教材中“PCR技術”中的教學釋疑[J].理科考試研究,2016,23(05):94.</h3></br><h3>來源：追光的人</h3></br><h3>編輯：彭草</h3></br> <p class="ql-block"><a href="https://mp.weixin.qq.com/s/rZUPF1j8uD-AeWpCKJrPug" target="_blank">查看原文</a> 原文轉載自微信公眾號,著作權歸作者所有</p>

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